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熒光定量pcr技術(shù)原理是怎樣的?

更新時(shí)間:2024-11-17   點(diǎn)擊次數(shù):29次
  熒光定量pcr技術(shù)是一種在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。以下是對(duì)其技術(shù)原理的詳細(xì)解釋:
  
  1、熒光化學(xué)物質(zhì)的使用:
  
  熒光染料和探針是兩種主要的熒光化學(xué)物質(zhì)。非特異性檢測(cè)方法使用過量的熒光染料,如SYBRGreenI,這些染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后發(fā)射出熒光信號(hào)。特異性檢測(cè)方法則利用標(biāo)記有熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物。
  
  2、Ct值與起始模板量的關(guān)系:
  
  在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期,模板的Ct值(即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與其起始拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系。這意味著,通過測(cè)量Ct值,可以推算出起始模板的數(shù)量。
  

熒光定量pcr技術(shù)

 

  3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:
  
  為了對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析,需要首先建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。這通常通過使用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并測(cè)量其Ct值來實(shí)現(xiàn)。然后,將Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)作圖,得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
  
  4、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與定量:
  
  qPCR技術(shù)的核心在于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程中的熒光信號(hào)變化。隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行,熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),當(dāng)信號(hào)達(dá)到預(yù)設(shè)的閾值時(shí),記錄此時(shí)的循環(huán)次數(shù)(Ct值)。由于熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步,因此可以通過測(cè)量熒光信號(hào)的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程,并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。
  
  總的來說,熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合了PCR技術(shù)的高靈敏性和光譜技術(shù)的高精確性,使得DNA定量分析更加準(zhǔn)確、快速和方便。它廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究、病原體檢測(cè)、腫瘤基因檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。

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